Évaluation pharmaceutique IND / NDA pour l'application de produits de thérapie génique

 

Évaluation pharmaceutique IND / NDA pour l'application de produits de thérapie génique. Comparés à d'autres vecteurs viraux, les vecteurs de virus adéno-associés recombinants (rAAV) présentent les avantages d'une forte capacité d'infection, d'une expression durable des gènes cibles, de la non-pathogénicité et de l'intégration non génomique, etc., et sont devenus le principal vecteur viral du gène. thérapie in vivo.

Cet article résume les derniers progrès de la recherche sur les produits de thérapie génique rAAV et discute des points clés de l'évaluation pharmaceutique de ces produits sous les aspects des matières premières, de la technologie de production et du contrôle qualité, afin de promouvoir la transformation clinique et l'application de ces produits. En même temps, les points de considération de l'évaluation de la pharmacie et les problèmes communs de 3 produits commercialisés à l'étranger sont discutés.

 

L'état de développement de l'industrie de la thérapie génique rAAV

Selon des statistiques incomplètes, au moins 238 produits de thérapie génique rAAV font actuellement l'objet d'essais cliniques, et 3 produits de thérapie génique rAAV ont été enregistrés en Europe et aux États-Unis (tableau 1).

Tableau 1 Application clinique des produits de thérapie génique rAAV

 

 

1. Contenu de la recherche et évaluation des matières premières

1.1. Conception moléculaire du virus

La conception du vecteur du rAAV doit être basée sur l'efficacité et la sécurité cliniques, ciblant généralement des tissus ou des cellules spécifiques, en supprimant les gènes liés à la virulence, à la pathogénicité ou à la capacité de réplication pour garantir la sécurité du produit. Dans le même temps, la conception doit tenir compte de la taille du génome du vecteur, de l'efficacité de l'empaquetage et de l'efficacité d'expression, et minimiser l'homologie avec les virus apparentés dans le corps pour éviter la formation de virus se répliquant. Le risque d'introduction de gènes de résistance aux antibiotiques doit être pris en compte lors de la construction de plasmides viraux. En règle générale, les gènes de résistance à l'ampicilline ne doivent pas être utilisés.

1.2, matrice de cellules de production

Actuellement, la matrice cellulaire utilisée dans la production de rAAV dans l'industrie comprend des cellules de mammifères (HEK293, BHK), des lignées cellulaires tumorales humaines (HeLa, A549) et des lignées cellulaires d'insectes (SF9).

Les cellules d'emballage doivent être entièrement identifiées et une banque doit être créée. Les éléments d'identification comprennent généralement l'identification, la pureté, le génotype / phénotype, la tumorigénicité / tumorigénicité, la stabilité génétique et la séquence introduite. En plus des stériles conventionnels, des champignons et des mycoplasmes, une attention particulière doit être accordée aux virus spécifiques à l'espèce dans la matrice cellulaire. Par exemple: les cellules HEK293 doivent être testées pour CMV, VIH-1/2, HILV-1/2, HH-V6 / 8, virus JV, virus BK, EBV, parvovirus B19, HBV, HPV et HCV et d'autres virus; Les cellules SF9 doivent être testées pour les virus Spirogen Insect tels que le corps humain, le rhabdovirus.

Lors de l'utilisation de lignées de cellules tumorales humaines comme cellules d'encapsidation, le risque de tumorigénicité et de tumorigénicité, ainsi que l'infection par des virus tumorigènes, etc., doivent également être pleinement évalués. Par exemple, les cellules HeLa sont des cellules tumorales dérivées de tissus cancéreux du col de l'utérus humain, qui sont connues pour contenir 50 copies du génome du HPV-18 et de la séquence du gène E6 / 7 du virus. Par conséquent, il est recommandé de vérifier les résidus de gène de transfert dans le projet de contrôle de qualité.

 

 

2. Recherche et évaluation du processus de production

2.1. Processus en amont des produits AAV

2.1.1. Méthode de transfert transitoire multi-plasmidique

Le premier processus de production de rAAV utilisait des plasmides et des virus auxiliaires pour infecter les cellules d'encapsidation. À l'heure actuelle, le procédé de production de co-transfection HEK 293 à trois plasmides est principalement utilisé. Les cellules HEK293 contiennent les gènes E1a et E1b de l'adénovirus (AdV), co-transfectés avec le plasmide de transfert (contenant le gène cible et la séquence ITR), et le plasmide structurel (contenant le gène rep / cap) et les plasmides auxiliaires (répliquant les gènes viraux E2A , E4, VARNA, etc.), le rAAV peut être recombiné et conditionné après 48 à 72 h.

Cette méthode convient à une variété de sérotypes de rAAV, et le rendement de fermentation peut généralement atteindre 1014 VG par millilitre (génome vecteur), ce qui peut généralement atteindre la quantité de rAAV dans les premiers essais cliniques (<1015 VG). Cependant, en raison des limites des méthodes de culture adhérentes, le processus transitoire multi-plasmidique est difficile à répondre aux besoins de la production commerciale (> 1016 VG).

2.1.2, méthode de cellule de production stable

Construire une lignée cellulaire HeLa transfectée stable contenant le gène auxiliaire rep / cap et le gène cible, et le virus rAAV peut également être emballé après une infection par adénovirus. En utilisant notamment la lignée cellulaire HeLa S3 qui peut être cultivée en suspension, la méthode de production de cellules stables peut être directement mise à l'échelle jusqu'à une échelle de 2000 L. De même, la construction de cellules BHK contenant le gène ICP27, après transfection avec la réplication- d27.1HSV défectueux contenant le gène auxiliaire et le gène cible, peut également exprimer efficacement rAAV.

Cependant, les principaux inconvénients de la méthode des cellules stables sont que la construction cellulaire et les études de stabilité génétique prennent du temps et que l'utilisation de virus auxiliaires dans le processus de production pose un risque pour la sécurité des virus.

2.1.3 Méthode de l'infection par baculovirus des cellules d'insectes

Le baculovirus a un degré élevé de spécificité d'espèce, n'infecte pas les vertébrés et peut transférer des gènes de rAAV et des éléments à fonction trans-agissant aux cellules d'insectes SF9. Par conséquent, ces dernières années, il a également commencé à être utilisé dans la production de masse de rAAV. Les avantages de cette méthode sont que le baculovirus a une bonne sécurité biologique, une efficacité d'infection élevée et le processus de production est facile à mettre à l'échelle. Cependant, le baculovirus résiduel et les substances liées à l'ADN devraient également être pris en compte dans les projets de contrôle de la qualité.

Points clés de l'évaluation de la pharmacie:

Pour le processus de production en amont du rAAV, l'évaluation de la pharmacie suggère qu'une attention particulière devrait être accordée au développement des processus et à la vérification des processus clés. Par exemple, la transfection transitoire de plusieurs plasmides ou l'ajout de virus auxiliaires doit être utilisé pour expliquer la plage de contrôle des paramètres clés du processus et l'expérience intermédiaire à travers le développement et la vérification de processus. Des normes, telles que le rapport des différents vecteurs, la quantité de réactif de transfection, la multiplicité de l'infection du virus auxiliaire et de la cellule de production, etc.

 

2.2 Processus en aval des produits AAV

2.2.1, processus de purification

Le processus de purification du rAAV comprend généralement la récolte des milieux de culture cellulaire, la lyse des cellules par méthode chimique / physique, la digestion par enzyme benzonase pour éliminer les substances d'acide nucléique, la chromatographie en plusieurs étapes et la centrifugation en gradient de densité, le remplacement des tampons de formulation de formulation et d'autres processus. Parmi eux, la chromatographie d'affinité simule les cellules. La liaison du récepteur capture le rAAV. Par exemple, la charge de sulfate d'héparine peut se lier spécifiquement à rAAV2, et la charge d'agarose AVB peut se lier à divers sérotypes de rAVV tels que 1, 2, 3, 5 et 8 [22]. Pour l'élimination des supports vides, des méthodes d'ultracentrifugation à l'iodixanol et au chlorure de césium sont actuellement utilisées.

Il convient de noter que l'examen général pertinent de la pharmacopée chinoise indique clairement que «sauf indication contraire, la méthode de centrifugation par densité chlorure de césium-bromure d'éthidium ne doit pas être utilisée pour la purification des produits de thérapie génique».

2.2.2, vérification de la suppression des virus

Comme mentionné ci-dessus, un baculovirus ou un virus auxiliaire (HSV, Ad5, etc.) est utilisé lors de l'utilisation d'un processus de production de cellules baculovirus-insecte ou de lignée cellulaire de transfection stable (HeLa). Par conséquent, les processus en aval doivent ajouter des procédures spécifiques de suppression / inactivation de virus.

Par exemple: en utilisant le tensioactif TritonX-100 (0,5%, v / v) et en ajoutant un processus de filtration de virus pour éliminer le baculovirus résiduel dans le liquide de récolte; en utilisant des surfactants, une inactivation à faible pH et d'autres procédés pour éliminer le virus HSV; utilisant des ions La méthode d'échange, le chauffage de courte durée (52 ℃, 10 min) et la nanofiltration sont utilisés pour éliminer les adénovirus.

2.2.3, prescription de formulation

Étant donné que la protéine de capside du rAAV n'est pas sensible aux changements de température et de pH, la formulation des produits rAAV est relativement simple à développer. Il est couramment utilisé pour ajouter 200 mmol·L-1 sulfate de magnésium ou 0,001% de poloxamère F68 à la solution saline pour éviter la formation d'agrégats, qui peuvent essentiellement soutenir le stockage à long terme (-65 ℃) et la stabilité au transport.

Points d'évaluation:

Pour le processus de production en aval du rAAV, l'évaluation de la pharmacie recommande de combiner l'efficacité d'élimination des impuretés liées au produit et des impuretés liées au processus pour évaluer la rationalité et la robustesse du processus de purification. Pour le processus de production utilisant le virus auxiliaire, la vérification du processus d'élimination / d'inactivation du virus doit être effectuée en combinaison avec la teneur en virus du liquide de récolte, et la sécurité résiduelle du virus doit être évaluée de manière exhaustive.

 

 

 

3. Vérification de la suppression des virus

3.1. Impuretés liées

3.1.1. Impuretés liées au processus

Les impuretés liées au processus des produits rAAV comprennent la protéine hôte, l'ADN hôte, le virus auxiliaire, le plasmide, le sérum et le chlorure de césium introduits dans le processus de conditionnement et de purification du virus. Etant donné que les cellules d'encapsidation virale contiennent généralement des oncogènes, par exemple, les cellules HEK293 contiennent des gènes d'adénovirus E1A et les cellules HeLa contiennent des oncogènes E6 et E7. Par conséquent, en général, la teneur en ADN résiduel de la cellule hôte doit être inférieure à 10 ng / dose et le fragment d'ADN résiduel doit être inférieur à 200 pb.

3.1.2. Impuretés liées au produit

Les impuretés pertinentes dans les produits rAAV comprennent les virus vides avec des gènes non emballés, les virus avec des gènes mal emballés (ADN hôte, gènes cibles incomplets, gènes de virus auxiliaires, etc.), des particules virales infectieuses, des agrégats ou des particules virales oxydées, etc.

Ces impuretés liées au produit ne parviennent pas seulement à atteindre l'expression du gène cible dans les cellules cibles, mais peuvent également provoquer une immunogénicité clinique ou une génotoxicité. Par exemple, dans un système à séquences multi-plasmidiques, la proportion de virus vides peut atteindre 50% à 98%. Les virus vides ne sont pas capables d'infecter et sont faciles à former des agrégats viraux et à se dégrader, provoquant une réponse immunitaire dans le corps. Par conséquent, les techniques A260 / A280, de microscopie électronique à transmission, de centrifugation analytique et de spectrométrie de masse devraient être utilisées dans la recherche de qualité pour détecter le contenu viral vide.

L'AAV compétent pour la réplication (rcAAV) est dû aux impuretés liées au produit produites par les gènes rep et cap / AAP d'empaquetage du virus rAAV après une recombinaison homologue / non homologue.
rcAAV peut être répliqué et amplifié en présence d'un virus auxiliaire. La détection de rcAAV adopte généralement l'utilisation de cellules sensibles pour l'amplification en présence de virus auxiliaire. Après que le lysat cellulaire a été amplifié et passé plusieurs fois, Southern blot et qPCR sont utilisés pour déterminer le gène rep ou cap. Par exemple, le produit rAAV scAAV2 / 8-LP1-hFIXco, qui est entré dans les essais cliniques, utilise la qPCR pour contrôler la teneur en rcAAV à moins de 1 / 2,25 × 106. Il existe également des rapports indiquant qu'en utilisant une technologie transitoire multi-plasmidique optimisée, la limite de contenu en rcAAV peut être inférieure à 1/108 VG

 

3.2. Éléments généraux de contrôle de la qualité

Le contrôle de la qualité de la production de virus rAAV comprend le contrôle du processus et les tests de libération du produit final (tableau 2).

Par exemple: le plasmide utilisé pour le conditionnement du virus doit être soumis à un contrôle de qualité tel que l'identification, le contenu, la pureté, le résidu d'ADN de la cellule hôte, l'efficacité de la transfection, l'endotoxine bactérienne, la stérilité, etc.

Le liquide de récolte de virus doit contrôler la détection de facteurs étrangers (stériles, mycoplasmes, etc.), de virus étrangers, de virus cibles, etc.

Les éléments de libération de la solution mère de rAAV et de la préparation comprennent généralement l'apparence, les propriétés physiques et chimiques (valeur du pH, pression osmotique), le titre viral (titre physique, titre infectieux), la pureté (pureté des protéines, rapport d'absorbance, résidu d'ADN hôte, résidu d'ADN plasmidique) , acide nucléique) résidu enzymatique), efficacité (expression du gène cible, activité in vitro, activité in vivo), sécurité
(endotoxine, stérile, rcAAV).

De plus, pour les préparations ophtalmiques de rAAV, la teneur en endotoxines ne doit pas être supérieure à 2,0 UE / dose / œil ou 0,5 UE / ml, les particules insolubles doivent être contrôlées selon les préparations ophtalmiques (USP <789>) et les tests de libération du produit doivent inclure Produits après configuration, etc.
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3.3. Méthode de mesure de la puissance

La méthode de détermination de l'activité des produits rAAV doit refléter le titre physique, l'activité infectieuse et l'activité biologique du virus.

En général, la méthode qPCR peut être utilisée pour déterminer le génome viral au stade précoce des essais cliniques, et des cellules sensibles ou des cellules ciblées peuvent être utilisées pour déterminer leur capacité d'infection et leur capacité d'expression de produit cible pour caractériser l'efficacité du produit.

Après la réalisation des principaux essais cliniques, la méthode d'activité enzymatique in vitro ou la méthode d'expérimentation fonctionnelle in vivo qui reflète le mécanisme d'action du produit doit être développée davantage. Par exemple, après que le SPK-RP65 entre dans les essais cliniques de phase III, l'efficacité du produit est calculée en transfectant des cellules indicatrices (HEK293-LRAT) et en mesurant la teneur en rétinol du produit promu par la protéase de RPE65.

Il convient de souligner que l'ADN linéaire doit être utilisé pour dessiner une courbe standard pour la méthode qPCR de détermination du génome viral. Si de l'ADN superenroulé est utilisé comme référence, la valeur mesurée du contenu du génome du vecteur est significativement plus élevée que la valeur réelle.

 

 

 

4. Analyse de 3 exemples de produits géniques répertoriés

À l'heure actuelle, seuls trois produits de thérapie génique rAAV (glybera, luxturna et zolgensma) ont été approuvés pour commercialisation dans le monde. La plupart de ces produits en Chine sont au stade précoce de la recherche et du développement, et l'industrie et les régulateurs manquent de recherche pharmaceutique et d'évaluation des produits de thérapie génique rAAV. Vivre. Ce qui suit est de discuter des points clés et des problèmes communs de l'évaluation pharmaceutique de ces produits sur la base des informations divulguées dans les rapports d'évaluation des produits commercialisés à l'étranger.

4.1, Glybera

Glybera (alipogène tiparvovec, AAV1-LPLS447X) est un produit de thérapie génique rAAV2 développé par Amsterdam Molecular Therapeutics qui porte le gène humain LPLS447X. Il est cliniquement utilisé pour traiter le déficit en lipoprotéine lipase chez l'adulte par injection intramusculaire.

Il y a des changements de processus majeurs pendant le développement du processus de ce produit: le processus de production de première génération (AMT-010) utilise le système d'expression HEK293, et le processus de production commerciale (ATM-011) utilise l'expression du système baculovirus-cellule d'insecte, donc la pharmacie a été développée. Et des études de comparabilité non cliniques.

Dans le processus en aval, le modèle de réduction de l'échelle du processus a été utilisé pour vérifier le processus d'élimination des virus enveloppés et des virus non enveloppés.

L'étude de qualité a mené des études de caractérisation adéquates sur 3 lots de lots de production continue, notamment: les composants (intégrité / taille génomique, analyse des protéines, masse moléculaire, protéine de capside); propriétés physiques (taille des particules, glycosyle des particules virales) Modification chimique); structure primaire (confirmation de séquence, identification des protéines); structure avancée (microscopie électronique à lentille, ultracentrifugation analytique); activité biologique (particules infectieuses, activité spécifique, puissance), etc.

L’examen de l’EMEA a conclu qu’étant donné que le liquide de récolte cellulaire contient une grande quantité de baculovirus infectieux et que le processus en aval ne peut pas fournir un effet de suppression du virus suffisant, le demandeur est tenu de fournir un rapport d’analyse des risques pour l’injection clinique d’ADN résiduel de baculovirus, et il est recommandé que le produit soit libéré. ​​Vérifiez que des éléments tels que les résidus de baculovirus infectieux et le rcAVV sont ajoutés aux éléments de test.

En outre, l'examen de l'EMEA recommande que le processus de production après la mise sur le marché du produit augmente davantage le processus d'élimination du baculovirus (comme la filtration du virus) et les impuretés (ADN cellulaire d'emballage, gènes Rep / Cap résiduels, rcAAV, baculovirus infectieux , etc.) devrait être augmentée ultérieurement. Sensibilité de la méthode de détection.

 

4.2 Luxturna

Luxturna (voretigene neparvovec-rzyl, SPK-RPE65) est un produit de thérapie génique rAAV-2 portant le gène RPE65 humain développé par Spark Therapeutics, USA. Il est cliniquement utilisé pour l'injection sous-rétinienne pour traiter l'amaurose congénitale.

Le produit adopte trois plasmides pour co-transfecter les cellules adhérentes HEK293 et ​​le processus de production du flacon roulant. Le processus de production comprend: l'expansion cellulaire, la transfection, le remplacement du milieu, la solution de culture de récolte, la filtration à flux tangentiel, l'homogénéisation, la chromatographie d'échange d'ions, la centrifugation en gradient de densité, le remplacement et la filtration du tampon de préparation, etc.

Avant l'essai clinique de phase III de ce produit, le site, le contenant d'emballage et d'autres changements de processus se sont produits, et la méthode «côte à côte» a été utilisée pour mener des recherches de comparabilité des produits sur la qualité des produits.

Les éléments de test de libération du produit comprennent: les éléments physiques et chimiques (apparence, pH, concentration, volume extractible), l'identification (gène cible), le contenu (concentration du génome), l'efficacité (expression du gène cible, activité in vitro), la pureté et les éléments de sécurité (endotoxine) , Particules, stériles), etc. L'ADN hôte, l'ADN plasmidique, le gène E1A et l'albumine sérique bovine et d'autres impuretés liées au processus sont contrôlés dans la recherche de qualité.

La FDA examine que la stabilité de la cellule d'emballage HKE293 et ​​la stabilité en temps réel du produit devraient continuer à être achevées après la commercialisation du produit.

4.3, Z accordma

Zolgensma (onasemnogene abeparvovec, AVXS-101) est un produit de thérapie génique rAAV9 développé par AveXis qui porte le gène Survival Motor Neuron (SMN). Il est cliniquement injecté par voie intraveineuse pour traiter l'atrophie musculaire spinale chez les enfants.

Dans le processus de développement de processus de ce produit, la méthode d'évaluation des risques est utilisée pour déterminer les attributs de qualité clés de ce produit en combinaison avec les attributs de qualité cibles, et le modèle de réduction à l'échelle du processus est utilisé pour déterminer l'espace de conception du processus et la vérification du processus;

Ce produit a subi des changements de site, de processus et de formulations avant le lancement des principaux essais cliniques et avant l'enregistrement et la commercialisation.

La FDA a examiné et déterminé que la pureté du produit et l'efficacité de l'unité VG étaient cohérentes avant et après le changement de procédé; les items de test de «puissance» de ce produit comprennent à la fois la détection quantitative des niveaux d'expression de la protéine SMN dans les cellules cibles et la détection semi-quantitative in vivo du «taux de survie» de la souris.

Il est à noter qu'en raison du manque de précision et d'exactitude de la méthode d'analyse du «contenu» de ce produit lors du développement des essais cliniques de phase І, une méthode mise à jour a été utilisée pour réviser la posologie clinique après 44 mois. De plus, dans l'expérience de stabilité de ce produit, une diminution du «contenu» et de «l'efficacité» a été observée.

 

 

 

 

(source: internet, référence uniquement)