Localisation et rôle de la réponse des lymphocytes T chez les souris infectées par le SRAS-CoV-2

 

L'emplacement et le rôle de la réponse des lymphocytes T chez les souris infectées par le SRAS-CoV-2. Les cellules T spécifiques du virus (y compris le SRAS-CoV et le MERS-CoV) jouent un rôle important dans la résistance à diverses infections virales.

Bien que des cellules spécifiques du SRAS-CoV-2 ont été identifiées chez des patients atteints de COVID-19, leur rôle dans la protection des souris infectées par le SRAS-CoV-2 n'a pas encore été déterminé. Ici, nous avons utilisé un adénovirus exprimant le récepteur humain (Ad5-hACE2) pour transduire des souris sensibles à l'infection par le SRAS-CoV-2. Chez les souris BALB / c et C57BL / 6, nous avons identifié l'épitope de cellule T spécifique de CD4 + et CD8 + T SARS-CoV-2 reconnu par les cellules. Les cellules spécifiques du virus sont multifonctionnelles et peuvent lyser les cellules cibles dans le corps.

De plus, après une infection par le SRAS-CoV-2, la voie de l'interféron de type I s'est avérée être la clé des réponses optimales des cellules T antivirales. La vaccination du vaccin contre les lymphocytes T seul peut protéger les souris infectées par le SRAS-CoV-2 contre des maladies graves. De plus, les résultats de l'étude ont montré qu'il existe une réponse croisée des cellules T entre le SRAS-CoV et le SARS-CoV-2 chez la souris, mais il n'y a pas de croisée entre le MERS -CoV et le SRAS-CoV-2. Comprendre le rôle de la réponse des lymphocytes T guidera la recherche sur la pathogenèse immunitaire du COVID-19 et la conception et la vérification des vaccins.

 

Introduction:

Un nouveau β-coronavirus, le coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère de type 2 (SRAS-CoV-2), a été signalé à Wuhan en décembre 2019. L'agent pathogène de la maladie à coronavirus de 2019 a été publié par l ' Organisation mondiale de la santé. Une urgence de santé publique internationale a été déclarée en janvier 2020. Au 5 décembre 2020, plus de 65 millions de personnes ont été infectées dans le monde et plus d'un million de décès.

La clairance virale lors d'une infection virale respiratoire primaire dépend de la production de réponses cellulaires CD4 + et T CD8 + spécifiques du virus. Bien que les infections virales respiratoires provoquent parfois des réponses anticorps transitoires, les cellules spécifiques du virus ont tendance à être plus persistantes. Par exemple, parmi les survivants du SRAS, les cellules T spécifiques du coronavirus du SRAS peuvent être détectées 17 ans après l'infection. Des réponses des lymphocytes T spécifiques du MERS-CoV ont été détectées chez la plupart des patients, y compris des patients asymptomatiques dont la réponse anticorps ne peut pas être détectée.Récemment, des cellules spécifiques du SRAS-CoV-2 ont été rapportées chez des patients atteints de COVID-19 pendant les phases aiguës et convalescentes, et ces cellules sont diffusées liées à la gravité de la maladie.

En outre, des lymphocytes T à réactivité croisée ont été trouvés chez des individus non exposés atteints du SRAS-CoV-2, ce qui aurait que les lymphocytes T préexistants à réactivité croisée contre les coronavirus respiratoires saisonniers ou des agents pathogènes non identifiés pourrait être immunisés contre le COVID-19. Jouez un rôle dans le mécanisme.

Les souris sont des animaux idéaux pour étudier la pathogenèse et évaluer de nouvelles thérapies et vaccins. Notre étude précédente a identifié des cellules T CD4 + et CD8 + spécifiques au SRAS-CoV et au MERS-CoV chez la souris par l'expression d'IFN-γ après stimulation peptidique de l'épitope. Les souris SCID et RAG - / - déficientes en cellules T CD4 + et CD8 + ont une clairance virale retardée. La diminution de la réponse des lymphocytes T CD8 + spécifiques au SRAS-CoV dans les poumons des souris âgées est lié à l'augmentation de la mortalité. Chez les souris C57BL / 6 et BALB / c infectées, des cellules T CD8 + spécifiques du MERS-CoV sont également nécessaires pour éliminer le virus.Ces résultats soutiennent l'ensemble le rôle clé des cellules T dans l'élimination du virus chez les souris infectées par le CoV.

Récemment, nous avons utilisé un adénovirus déficient en réplication (Ad5-hACE2) pour délivrer de manière exogène ACE2 humain (hACE2) pour établir un modèle de souris COVID-19. La transduction Ad5 peut prendre en charge la réplication du CoV dans les poumons de souris 17 à 22 jours après la transduction. Des souris sensibilisées à Ad5-hACE2 ont développé une pneumonie, qui se manifeste par une perte de poids, une maladie pulmonaire grave, une réplication du virus à titre élevé dans les poumons et une forte réponse immunitaire adaptative antivirale. Les souris transgéniques Ad5-hACE2 peuvent étudier la pathogenèse immunitaire et évaluer rapidement les médicaments antiviraux et les candidats vaccins.Jusqu'à présent, aucun épitope de lymphocytes T CD4 + ou CD8 + n'a été trouvé chez les souris infectées par le SRAS-CoV-2, et l'analyse fonctionnelle des lymphocytes T spécifiques du virus est incomplète.

Ici, nous avons utilisé des souris transgéniques Ad5-ACE2 pour identifier les épitopes de cellules T spécifiques du SARS-CoV-2 chez les souris BALB / c et C57BL / 6. Nous avons constaté que les lymphocytes T CD4 + T et CD8 + spécifiques au SRAS-CoV-2 ont une polyvalence et une cytosolubilité. L'inoculation de cellules T sans anticorps neutralisants peut protéger les souris de l'infection par le SRAS-CoV-2. De plus, il existe une réaction croisée des lymphocytes entre le SARS-CoV et le SARS-CoV-2 chez la souris, mais il n'y a pas de réaction croisée entre le MERS-CoV et le SARS-CoV. Cette étude fournit une base pour la recherche sur la pathogenèse immunitaire, la conception de vaccins et la vérification in vivo.

 

 

Résultats:

Identification des épitopes des lymphocytes T CD4 + et CD8 + chez les souris WT-BALB / c et C57BL / 6 infectées par le SRAS-CoV-2

Afin de localiser les épitopes de lymphocytes T CD8 + restreints au CMH de classe I et CD4 + restreints au CMH de classe II, un groupe de quatre protéines structurales du SRAS-CoV-2 (spike [S] glycoprotéine, nucléocapside [N] protéine , transmembranaire [M] et enveloppe [E] protéine) 20 peptides. Ces peptides se chevauchent de 10 acides aminés. Initialement, l'expression SARS-CoV-2-S, SARS-CoV-2N, SRAS-Encéphalite équine vénézuélienne réplique particules (VRP) de CoV-2M, SARS-CoV-2E, ORF3a, ORF6, ORF7a et ORF9c.

Les souris ont été inoculées avec VRP dans, 7 jours après l'inoculation, les cellules ont été séparées des poumons, et 5 μM de chaque 20 peptides ou 10 μM de chaque mélange de peptides protéiques ont été utilisés dans la brefeldinA (brefeldin; protein Stimuler pendant 5-6 heures en présence de Inhibiteurs de transport. Coloration de cytokines intracellulaires (ICS) par antigène pour identifier des lymphocytes T. Pour les souris BALB / c (restreintes à H-2d), par rapport au groupe témoin sans peptide, six peptides (N-7, N-25, N-36, S-7, S-45 et F8-5;

Figure S1 A) et quatre peptides (N-9, S-27, S-54 et S-106; Figure S1 B) peuvent stimuler les cellules T CD4 + et CD8 + pour produire respectivement l'IFN-γ. Pour les souris C57BL / 6 (restreintes à H-2b), sept peptides (N-1, S-3, S-7, ORF3a-16, ORF3a-27, ORF3a-28 et ORF7a-7; Figure S2 A) et 24 peptides (M-18, N-11, N-22, N-23, N-28, S-8, S-10, S-13, S-14, S-22, S-23, S-24 , S-26, S-27, S-48, S-51, S-52, S-54, S-55, S-57, S-82, ORF3a-11, ORF7a-9 et ORF7a-10); La figure S2 B) peut stimuler les cellules T CD4 + et CD8 + chez les souris immunisées par VRP.Il convient de noter que le vaccin VRP peut induire des niveaux élevés d'expression génique exogène et induire efficacement des réponses humorales et des cellules T chez la souris, comme nous avons décrit précédemment (Sun et al., 2020; Zhao et al. ., 2016). En utilisant notre méthode de localisation, il est peu probable que les épitopes dominants des lymphocytes T soient manqués; cependant, nous ne pouvons pas exclure cette possibilité. Utilisez le serveur de consensus d'épitopes de cellules T (Rankpep, Immune Epitope Database and Analysis Resource, et SYFPEITHI) pour analyser plus en détail ces peptides. Une série de peptides tronqués ont été synthétisés et les cellules pulmonaires de souris BALB / c et C57BL / 6 ont été utilisées pour identifier des épitopes précis.Comme le fait la figure SI (C et D) et la figure S2 (C et D), le peptide tronqué qui a induit la plus forte réponse des lymphocytes T dans le même groupe de 20 peptides tronqués peptides a été sélectionné comme peptide épitope de lymphocytes T candidat.

Pour confirmer ces épitopes, des souris BALB / c et C57BL / 6 ont été transduites avec Ad5-ACE2, et 5 jours plus tard, 1 x 105 PFU SARS-CoV-2 a été utilisé pour l'infection. Un liquide de lavage bronchoalvéolaire (balf) a été prélevé 8 jours après l'infection, et les cellules ont été stimulées avec les peptides épitopes ccandidate indiqué. La méthode ICS a été utilisée pour déterminer l'effet de la production d'IFN-γ sur la réponse des lymphocytes T. Un total de 6 épitopes de lymphocytes T CD4 + restreints à I-Ad (figure 1A) et 3 épitopes de lymphocytes T CD8 + restreints à H-2K / D / Ld ont été confirmés (figure 1B; souris BALB / c), 5 I-Ab-restreints Epitopes de lymphocytes T CD4 + (figure 1C) et 10 épitopes de lymphocytes T CD8 + restreints à H-2K / Db (figure 1A; souris C57BL / 6).

Il est à noter que certains épitopes candidats trouvés chez les souris vaccinées avec VRP ne sont pas apparus chez les souris infectées par le SRAS-CoV-2, ce qui peut refléter des différences dans les niveaux d'expression de protéines virales chez les souris infectées ou des épitopes in vivo Concurrence directe entre. Le tableau 1 résume les épitopes et leurs restrictions MHC. Sélectionnez l'épitope de lymphocytes T CD4 + dominant N351-365 (N351) chez les souris BALB / c, ORF3a 266-280 (ORF3a 266) chez les souris C57BL / 6 et CD8 dominant chez les souris BALB / c + épitope de lymphocytes T S535-543 (S535) et S538-546 (S538) chez des souris C57BL / 6 ont été étudiées plus en détail.

Figure 1 L'identification des épitopes de lymphocytes T CD4 + et CD8 + chez les souris WT-BALB / c et C57BL / 6 infectées par l'
épitope de lymphocytes T CD4 + du SRAS-CoV-2 (A et B) (A ) et l'épitope de lymphocytes T CD8 + (B) dans souris BALB / c infectées. (C et D) Epitope de cellule T CD4 + (C) et epitope de cellule T CD8 + (D) chez des souris C57BL / 6 infectées. L'organigramme et l'histogramme sont affichés (n = 3; données vérifiées dans deux expériences indépendantes). Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM. Ag, antigène; pep, polypeptide.

 

 

Figure S1: Localisation des épitopes de cellules SARS-CoV-2t chez des souris BALB / c. (A) Un peptide de 5 uM 20-mer (20 acides aminés) a été utilisé pour stimuler les lymphocytes du poumon inoculé. La coloration intracellulaire IFN-γ détecte la réponse des lymphocytes T CD4 + spécifiques de l'antigène. (B) Un peptide de 5 uM 20-mer (20 acides aminés) a été utilisé pour stimuler les lymphocytes du poumon inoculé. Détection de la réponse des lymphocytes T CD8 + spécifiques à l'antigène. (C) Les lymphocytes du poumon inoculé ont été stimulés avec 5 uM de 20-mère (20 acides aminés) et le peptide 13-15-mère tronqué correspondant en présence de brefeldine A pendant 5 à 6 heures. La réponse des lymphocytes T CD4 + spécifiques de l'antigène a été analysée.(D) Les lymphocytes du poumon inoculé ont été stimulés avec 5 uM de 20-mère (20 acides aminés) et le peptide 8-9-mère tronqué correspondant en présence de brefeldine A pendant 5 à 6 heures. La réponse des lymphocytes T CD8 + spécifiques de l'antigène a été analysée. Les epitopes tronqués candidats sont marqués par # (n = 3; les données représentent au moins deux expériences indépendantes). Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM. Ag, antigène; pep, polypeptide.

Figure S2: Localisation de l'épitope sur des cellules SARS-CoV-2t de souris C57BL / 6. (A) Un peptide de 5 uM 20-mer (20 acides aminés) a été utilisé pour stimuler les lymphocytes du poumon inoculé. La coloration intracellulaire IFN-γ détecte la réponse des lymphocytes T CD4 + spécifiques de l'antigène. (B) Un peptide de 5 uM 20-mer (20 acides aminés) a été utilisé pour stimuler les lymphocytes du poumon inoculé. Détection de la réponse des lymphocytes T CD8 + spécifiques à l'antigène. (C) Stimuler les lymphocytes du poumon inoculé avec 5 uM 20-mer (20 acides aminés) et le peptide tronqué 13-15-mère correspondant. Détection de la réponse des lymphocytes T CD4 + spécifiques à l'antigène.(D) Les lymphocytes du poumon inoculé ont été stimulés avec 5 uM de 20-mer (20 acides aminés) et le peptide 8-9-mère tronqué correspondant. Détection de la réponse des lymphocytes T CD8 + spécifiques à l'antigène. Les epitopes tronqués candidats sont marqués par # (n = 3; données représentent au moins deux expériences indépendantes). Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM. Ag, antigène; pep, polypeptide.

 

La cinétique de la réponse des cellules T spécifiques du virus chez les souris BALB / c et C57BL / 6 infectées par le SRAS-CoV-2

Afin de comprendre les changements dynamiques de la réponse des lymphocytes T spécifiques du SRAS-CoV-2 après l'infection par le SRAS-CoV-2, les souris BALB / c et C57BL / 6 de type sauvage infectées ont été sacrifiées à 5, 8 et 10 dpi. à partir de BALF, de tissu pulmonaire, de LN de drainage pulmonaire (DLN) et de rate, et stimulé avec le peptide épitope de cellule T CD4 + ou CD8 + dominant indiqué. La fréquence des lymphocytes T IFN-γ + CD4 + reconnaissant le peptide N351 a culminé à 8-10 dpi, et il a été trouvé dans les voies respiratoires (figure 2A), le tissu pulmonaire (figure 2B), le DLN (figure S3A) ) et la rate de BALB / souris c (figure S3B) Le nombre maximum de cellules a été utilisé à 8 dpi.

La réponse des lymphocytes T CD8 + spécifiques au SRAS-CoV-2 - S535 a culminé au 8e jour après l'infection des souris BALB / c et s'est contractée rapidement à partir du 8e jour (Figure 2, c et d; Figure S3c et Figure S4 d). La cinétique des réponses des lymphocytes T CD4 + et CD8 + spécifiques du SARS-CoV-2 a été dirigée contre ORF3a 266 (Figure 2, E et F; Figure S3, E et F) et S538 (Figure 2, G et I; Figure S3, respectivement) G et I) Peptides, similaires aux tendances observées dans les voies respiratoires, les tissus pulmonaires, la DLN des souris BALB / c et les taux de souris C57BL / 6 transduites / infectées. La fréquence des lymphocytes T spécifiques du SRAS-CoV-2 dans les voies respiratoires est beaucoup plus élevée que celle des poumons, du DLN et de la rate.Les lymphocytes T spécifiques du virus dans les voies respiratoires qui se rencontrent pour la première fois des antigènes viraux sont essentiels pour assurer la médiation de la protection après les attaques de SRAS-CoV et de MERS-CoV (Zhao et al., 2016).

Figure 2: Infection par le SRAS-CoV-2 de souris BALB / c et C57BL / 6 BALF et cinétique de réponse des lymphocytes T spécifiques du virus. (A - D) Les lymphocytes ont été collectés dans les voies respiratoires et les poumons de souris WT BALB / c transduites / infectées à des moments déterminés après l'infection, et ont utilisé 5 µM N351 (A et B) et 1 µM S535 en présence de brefeldinA (C et D) Stimuler pendant 6 heures. BALF (A et c) et la fréquence (à gauche) et le nombre de cellules (à droite) D) des cellules spécifiques de l'antigène dans les poumons (B et D) sont indiqués (n = 3 ou 4 souris; les données représentent trois expériences).(EH) Recueillir les lymphocytes des voies respiratoires et pulmonaires de souris C57BL / 6 transduites / infectées aux moments spécifiés, et utiliser 5 μM ORF3a 266 (E et F) et 1 μM S538 (G et H) en présence de brefeldine A) Stimuler verser 6 heures. Affiche la fréquence (à gauche) et le nombre de cellules (à droite) des cellules spécifiques de l'antigène (n = 3 ou 4 souris; les données représentent trois expériences indépendantes). Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM. Ag, antigène; pep, polypeptide; pi, après infection.

 

 

Figure S3: Cinétique de réponse des cellules T spécifiques du virus dans la dln et la rate de souris BALB / c et C57BL / 6 infectées par le SRAS-CoV-2. (A - D) Des lymphocytes ont été obtenus à partir du DLN et de la rate de souris WT BALB / c transduites / infectées à des moments déterminés après l'infection, et ont utilisé 5 µM N351 (A et B) et 1 µM S535 en présence de brefeldine A (C et D) Stimuler pendant 6 heures. La fréquence (à gauche) et le nombre de cellules (à droite) D) des cellules T spécifiques de l'antigène dans le DLN (A et c) et la rate (B et D) sont indiqués (n = 3 souris; les données représentent une expérience).(E - H) Les lymphocytes ont été collectés à partir du DLN et de la rate de souris C57BL / 6 transduites / infectées aux points temporels désignés, et 5 uM ORF3a 266 (E et F) et 1 uM S538 (G et H) Pendentif stimulateur 6 heures. Affiche la fréquence (à gauche) et le nombre de cellules (à droite) des cellules spécifiques de l'antigène (n = 3; les données représentent une expérience). Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM. Ag, antigène; pep, polypeptide; pi, après infection.

 

Les cellules T CD4 + et T CD8 + spécifiques au SARS-CoV-2 sont polyvalentes

Ensuite, notre objectif est de décrire le phénotype et la fonction des réponses des lymphocytes T spécifiques du SRAS-CoV-2, en particulier les cellules infectantes les voies respiratoires des souris. La méthode d'expression IFN-γ a été utilisée pour détecter les cellules T N351-CD4 + des voies respiratoires et les cellules T S535-CD8 + de souris BALB / c transfectées / infectées, et le phénotype cellulaire spécifique du virus a été détecté par cytométrie en flux. Les marqueurs d'activation (CD44, CD43, CD11a, CD49d, CD27 et CD69) ont été régulés à la hausse comme prévu après avoir rencontré l'antigène sur les cellules T N351-CD4 + (figure 3A) et les cellules T S535- CD8 + (figure 3E).Les molécules d'adhésion (CD11a et CD49d) et les récepteurs de chimiokine (CXCR3, CXCR6 et CCR5) sont également régulés à la hausse, ce qui peut aider à la migration et à la localisation des lymphocytes T vers les voies respiratoires (Figure 3 , A et E). Les niveaux d'expression de la L-sélectine (CD62L) et du récepteur de chimiokine (CCR7) qui guident les cellules T dans les LN sont réduits (Figure 3,

CD103 et Ly6C sont exprimés sur les cellules T S535-CD8 +, mais pas sur les cellules T N351-CD4 +, ce qui est cohérent avec les études précédentes (Figure 3, A et E). Les marqueurs fonctionnels (CD107a / b) liés à la cytotoxicité des lymphocytes T ont été exprimés sur les lymphocytes T N351-CD4 + et les lymphocytes T S535-CD8 +, ce qui est différent des observations des lymphocytes T CD4 + spécifiques au N351 et des lymphocytes T CD8 + spécifiques au S535 pouvant lyser cellules cibles pulsées par peptide in vivo (Figure 3, D et H). En plus de CD107a / b, on pense que CD40L est associé à la destruction médiée par les cellules T CD4 +, tandis que les cellules T CD4 + ne sont pas exprimées sur les cellules T CD8 + spécifiques du virus (figures 3, A et E).

Nos résultats évaluent que les cellules T CD4 + sont cytotoxiques, ce qui est également cohérent avec les rapports précédents. Les molécules inhibitrices (CTLA-4 et PD-1) ont été régulées à la hausse, tandis que de faibles niveaux de KLRG1 et une forte expression de CD127 ont été observés sur les cellules T N351-CD4 +, mais plus élevé sur les cellules T S535-CD8 + (Figure 3, A et E). L'expression des marqueurs phénotypiques sur les cellules T S538-CD8 + de souris C57BL / 6 est similaire à celle des cellules T S535-CD8 + de souris BALB / c (figure S4A).

Les cellules T CD4 + spécifiques aux voies respiratoires N351 et les cellules T CD8 + spécifiques S535 ont des fonctions effectrices supérieures, qui peuvent produire plus de trois cytokines (IFN-γ, TNF, IL-10 et IL-2) en même temps ( Figure 3, B et F). Les cellules T CD8 + spécifiques de S538 chez les souris C57BL / 6 produisent principalement de manière synergique IFN-y et TNF (figure S4B). Des cellules spécifiques au virus qui produisent de l'IL-10 ont également été trouvées chez des souris infectées par le SRAS-CoV-2, ce qui est cohérent avec l'étude du virus de la grippe A.De plus, les lymphocytes T CD4 + spécifiques du virus et les lymphocytes T CD8 + dans les voies respiratoires ont montré une plus grande affinité fonctionnelle que ceux des poumons, signalent que les lymphocytes T spécifiques des voies respiratoires étaient plus sensibles à l'imitation de l'antigène viral (Figure 3, C Et G; et Figure S4 C).

 

Figure 3: Les cellules T CD4 + et T CD8 + spécifiques du SARS-CoV-2 ont une polyvalence. (A et E) Analyse phénotypique des cellules T CD4 + spécifiques du SARS-CoV-2-N351 (A) et des cellules T CD8 + spécifiques du SARS-CoV-2-S535 (E) dérivées de BALF. (B et F) définit l'expression de cytokines des cellules T CD4 + spécifiques de N351 dérivées des voies respiratoires (B) et des cellules T CD8 + spécifiques de S535 (F) (n = 3 souris; les données représentent deux expériences indépendantes ).(C et G) montre les courbes d'affinité fonctionnelle des cellules T CD4 + spécifiques des voies respiratoires et des poumons N351 (C) et des cellules T CD8 + spécifiques S535 (G) (à gauche) et la quantité de peptide nécessaire pour la réponse demi-maximale (EC50) (à droite; n = 3 souris; les données représentent deux expériences indépendantes; le test T de Student; la valeur P de C est 0,0004; la valeur P de G est 0,0051) .(D et H) ont présenté des histogrammes de flux représentatifs du SRAS-CoV-2 (à gauche) et le taux de destruction (à droite) de la cytotoxicité des lymphocytes T CD4 + spécifiques de N351 (D) et des lymphocytes T CD8 + spécifiques S535 (H) chez les souris infectées et simulées souris infectées (n = 5 souris / groupe; les données représentent deux expériences indépendantes; test T de Student; D une valeur P de 0,0062; H une valeur P de 0 , 0002). *, P <0,05; ***, P <0,0005. Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM. Max, valeur maximale; pep, polypeptide.

 

Figure S4: Les cellules T CD8 + spécifiques du SARS-CoV-2 infectées par des souris C57BL / 6 sont multifonctionnelles. (A) Les cellules BALF sont colorées avec des anticorps contre les marqueurs indiqués. L'histogramme présenté ici est déclenché sur les cellules T CD8 + spécifiques du SARS-CoV-2-S538. (B) montre l'expression de cytokines de cellules T CD8 + spécifiques du SRAS-CoV-2-S538 dérivées des voies respiratoires (n = 3 ou 4 souris; les données représentent une expérience). (C) montre la courbe d'affinité fonctionnelle des cellules T CD8 + spécifiques du SARS-CoV-2-S538 dérivées des voies respiratoires et des poumons (à gauche) et la quantité de peptide nécessaire pour la réponse demi-maximale (EC50) (à droite; n = 3);Les données représentent deux expériences indépendantes; Test StudentT; La valeur P de C est 0,011). (D) montre l'histogramme de flux représentatif de la cytotoxicité CD8 + T spécifique du SRAS-CoV-2-S538 chez les souris infectées par le SRAS-CoV-2 et les souris infectées simulées (à gauche) et le taux de mise à mort (à droite) (N = 5; les données représentent une expérience; Test T de Student; Valeur P de C <0,0001). ****, P <0,0001. Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM. Maximum, maximum; pep, polypeptide.

 

 

La transduction du signal IFN de type I (IFN-I) est la clé d'une forte réponse des lymphocytes T contre l'infection par le SARS-CoV-2

L'IFN-I est une partie importante de l'immunité innée, déclenchant un «état antiviral» dans les tissus infectés. L'IFN-I affecte également la réponse immunitaire adaptative antivirale, y compris la réponse des lymphocytes T spécifiques du virus. Les patients atteints de COIVD-19 dont la fonction immunitaire est affaiblie ont souvent des maladies plus graves et un mauvais pronostic. Afin de clarifier le rôle de l'IFN-I dans la réponse des cellules T après une infection par le SRAS-CoV-2, nous avons étudié les cellules T N351-CD4 + et S535-CD8 + dans l'IFNAR (récepteur IFN de type I) KO-BALB / c de la dynamique des cellules T de souris et de la production de cytokines.Comme les souris BALB / c de type sauvage, les réponses des cellules T CD4 + et CD8 + spécifiques du virus ont atteint un pic au jour 8 après l'infection (figures 4, A et B).

Cependant, la fréquence et le nombre de cellules des lymphocytes T CD4 + spécifiques de N351 et des lymphocytes T CD8 + spécifiques de S535 chez les souris IFNAR KO BALB / c étaient significativement inférieurs à ceux des souris WT (Figure 4, c et D) . De plus, bien que certaines cellules IFNAR KO T soient déterminées comme multifonctionnelles en exprimant deux cytokines (IFN-γ combiné avec TNF ou IL-10 ou IL-2), la fréquence des cellules bifonctionnelles et multifonctionnelles est inférieure à celle des souris WT ( Figure 4, E et F). En outre, l'affinité fonctionnelle des cellules T CD4 + spécifiques du virus et des cellules T CD8 + chez les souris IFNAR KO est inférieure à celle des souris WT (Figure 4, G et H), signale que la perte de signal IFN- J'ai réduit le virus spécifique Cellules T.

La sensibilité des cellules aux antigènes peut être due à des modifications de l'environnement inflammatoire de différentes souches de souris ou à une expression accrue d'antigènes viraux chez les souris IFNAR-KO. Les souris IFNAR-KO ont un gain de poids retardé et une cinétique de clairance virale réduite au stade avancé de l'infection (jours 4 à 6; figure 4I). Cela peut être lié à une altération de la réponse des cellules T, car la réponse des cellules T commence à ce moment après l'infection. Les poumons apparaissent. Ces résultats évaluent le signal IFN-I est nécessaire pour le développement des lymphocytes T spécifiques du SARS-CoV-2 et l'optimisation des fonctions.

Figure 4: Le signal IFN-I est essentiel pour générer une forte réponse des lymphocytes T contre l'infection par le SRAS-CoV-2. (A et B) Afficher la fréquence (à gauche) et le nombre de cellules (à droite) des cellules T CD4 + spécifiques de N351 dérivées des voies respiratoires (A) et des cellules T CD8 + spécifiques de S535 (B) au moment spécifié (n = 3) Ou 4 souris / point de temps; données représentent trois expériences indépendantes). (C et D) Comparaison des réponses des cellules T CD4 + spécifiques aux voies respiratoires N351 (C) et des cellules T CD8 + spécifiques S535 (D) chez les souris WT et KO BALB / C (n = 3 ou 4 souris; les données représentent deux expériences indépendantes; test de StudentT; les valeurs P de C sont 0,0006 et 0,0013; les valeurs P de D sont 0,0005 et 0,0029).(E et F) montre des organigrammes représentatifs (à gauche) des cellules T CD4 + spécifiques de N351 (E) et des cellules T CD8 + spécifiques de S535 (F). La capacité d'expression de deux cytokines (les trois bons groupes) est statistiquement différente entre les souris WT et KO (n = 3 ou 4 souris; les données représentent deux expériences indépendantes; test t de Student; les valeurs P de E sont 0 , 0003, 0,0057 et suivants) 0,0004; Les valeurs P de F sont <0,0001, 0,0445 et <0,0001).(G et H) montre les courbes d'affinité fonctionnelle des cellules T CD4 + spécifiques de N351 (G) et des cellules T CD8 + spécifiques de S535 (H) chez les souris KO et WT (à gauche) et la quantité de peptide nécessaire pour la réponse demi-maximale (CE50) (à droite; n = 3 souris; les données représentent deux expériences indépendantes; test T de Student; la valeur P de G est 0,050; la valeur P de H est 0,052). (1) Mesurer la perte de poids et le titre viral du poumon à des moments déterminés (n = 3 à 5 souris / groupe / titre viral au point temporel; les données représentent deux expériences indépendantes; test t de Student; valeur P 0, 0291 et 0,0394). *, P <0,05; **, P <0,005; ***, P <0,0005; ***, P <0,0001.Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM. Ag, antigène; FFU, unité formant lésion; Max, valeur maximale; pep, peptide; pi, après infection.

 

Les cellules T CD4 + et CD8 + spécifiques aux épitopes protègent partiellement les souris infectées par le SRAS-CoV-2 d'une maladie grave

Ensuite, nous avons évalué si les cellules T spécifiques du SRAS-CoV-2 seules peuvent protéger les souris de l'infection. Comme mentionné précédemment, un ensemble de vecteurs VRP exprimant un seul épitope de cellule T immunodominante a été produit, y compris VRP-N351 (I-Ad, BALB / c), VRP-S535 (H-2Dd, BALB / c) et VRP -S358 (H-2Db, C57BL / 6). Prenez VRP-GFP comme contrôle. Les souris ont été immunisées deux fois toutes les 4 semaines et infectées le 28ème jour après le rappel (figure 5a). Le balf a été récolté au moment spécifié (figure 5a).

La coloration intracellulaire IFN-γ détecte les cellules T spécifiques de l'épitope. La vaccination avec VRP-N351, S353 et S358 sans VRP-GFP peut induire des réponses de cellules T spécifiques de l'épitope dans les voies aériennes, qui sont améliorées par l'amélioration et sont fortement rappelées après l'infection. Après l'immunisation, il a été appelé que le titre SARS-CoV-2 dans le poumon de la souris était modérément réduit et que les changements pathologiques dans le tissu pulmonaire étaient atténués (figure 5, BD).

Les anticorps neutralisants de différents groupes de vaccination VPR étaient inférieurs à la limite de détection lors de la provocation, et il n'y avait aucune différence dans les titres neutralisants demi-maximum dans le test de neutralisation de réduction de focalisation (FRNT50) à 14 dpi (figure S5), méritent qu'il résiste d'un virus- Des cellules spécifiques, plutôt que des anticorps neutralisants, ont un effet protecteur. Ces résultats évaluent que les cellules T spécifiques du virus induites par le vaccin contre une clairance virale plus rapide chez les souris infectées par le SRAS-CoV-2 et réduisent le degré de lésions pulmonaires.

 

Figure 5. Les cellules T CD4 + et CD8 + spécifiques de l'épitope protègent partiellement les souris infectées par le SRAS-CoV-2 de maladies graves. (A) Stratégie de vaccination VRP et défi SRAS-CoV-2. (B et C) Les effets des cellules T CD4 + spécifiques de N351 (B) et des cellules T CD8 + spécifiques de S535 (C) sur des souris BALB / C. Affiche le nombre de cellules T spécifiques de l'antigène dérivées des voies respiratoires (n = 3 ou 4 souris / groupe / point dans le temps; à gauche). Au moment spécifié (n = 4 souris / groupe / point dans le temps; milieu; les données représentent au moins deux expériences indépendantes; test t de Student; les valeurs P de B sont 0,0051 et 0,0403; les valeurs P de C sont 0,0026 et 0,0804) Mesurer le titre de virus pulmonaire.L'hématoxyline / éosine a été utilisée pour colorer des coupes pulmonaires incluses en paraffine de souris infectées (n = 3 souris par groupe à chaque instant; à droite; les données représentent au moins deux expériences indépendantes). Barre d'échelle, 100 mm. (D) L'effet des cellules T CD8 + spécifiques de S538 sur des souris C57BL / 6. Afficher le nombre de cellules au moment spécifié (n = 3 souris / groupe / point dans le temps; à gauche). Le titre du virus pulmonaire a été mesuré aux points temporels désignés (n = 4 souris / groupe / point temporel; milieu; les données représentent au moins deux expériences indépendantes; test t de Student; les valeurs D sont 0,0372 et 0,0043 ).Six jours après l'infection, des coupes pulmonaires incluses en paraffine de souris infectées ont été colorées avec de l'hématoxyline / éosine (n = 3 souris / groupe / point dans le temps; à droite; les données représentent au moins deux expériences indépendantes ). Barre d'échelle, 100 mm. *, P <0,05; **, P <0,005. Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM. Flèche, saignement; astérisque, œdème; Ag, antigène; D, jour; FFU, unité formant lésion; pi, après infection. la gauche).Le titre du virus pulmonaire a été mesuré aux points temporels désignés (n = 4 souris / groupe / point temporel; milieu; les données représentent au moins deux expériences indépendantes; test t de Student; les valeurs D sont 0,0372 et 0,0043 ). Six jours après l'infection, des coupes pulmonaires incluses en paraffine de souris infectées ont été colorées avec de l'hématoxyline / éosine (n = 3 souris / groupe / point dans le temps; à droite; les données représentent au moins deux expériences indépendantes ). Barre d'échelle, 100 mm. *, P <0,05; **, P <0,005. Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM. Flèche, saignement; astérisque, œdème; Ag, antigène; D, jour; FFU, unité formant lésion;pi, après infection. la gauche). Le titre du virus pulmonaire a été mesuré aux points temporels désignés (n = 4 souris / groupe / point temporel; milieu; les données représentent au moins deux expériences indépendantes; test t de Student; les valeurs D sont 0,0372 et 0,0043 ). Six jours après l'infection, des coupes pulmonaires incluses en paraffine de souris infectées ont été colorées avec de l'hématoxyline / éosine (n = 3 souris / groupe / point dans le temps; à droite; les données représentent au moins deux expériences indépendantes ). Barre d'échelle, 100 mm. *, P <0,05; **, P <0,005. Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM. Flèche, saignement; astérisque, œdème; Ag, antigène;D, jour; FFU, unité formant lésion; pi, après infection. Des coupes pulmonaires incluses dans la paraffine de souris infectées ont été colorées avec de l'hématoxyline / éosine (n = 3 souris / groupe / point dans le temps; à droite; les données représentent au moins deux expériences indépendantes). Barre d'échelle, 100 mm. *, P <0,05; **, P <0,005. Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM. Flèche, saignement; astérisque, œdème; Ag, antigène; D, jour; FFU, unité formant lésion; pi, après infection.Des coupes pulmonaires incluses dans la paraffine de souris infectées ont été colorées avec de l'hématoxyline / éosine (n = 3 souris / groupe / point dans le temps; à droite; les données représentent au moins deux expériences indépendantes). Barre d'échelle, 100 mm. *, P <0,05; **, P <0,005. Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM. Flèche, saignement; astérisque, œdème; Ag, antigène; D, jour; FFU, unité formant lésion; pi, après infection.

Figure S5: Les souris BALB / c n'ont pas d'anticorps neutralisants lorsqu'elles sont provoquées. Titre d'anticorps neutralisant de sérum de souris BALB / c inoculé et infecté à la provocation et à 14 dpi (n = 6; les données représentent une expérience). Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM. LOD, limite de détection; pi, après infection.

Il existe une réaction croisée entre l'infection par le SRAS-CoV-2 et le SRAS-CoV chez la souris

Le SRAS-CoV-2, le SRAS-CoV et le MERS-CoV sont trois coronavirus respiratoires humains hautement pathogènes appartenant au genre β-coronavirus. L'homologie du génome du SRAS-CoV-2 avec le SRAS-CoV et le MERS-CoV est de 79,6% et -40%, respectivement, que des épitopes de lymphocytes T à réactivité croisée peuvent exister. Cependant, les mêmes épitopes de lymphocytes T à réactivité croisée n'ont pas été réalisés. Auparavant, nous avons identifié tous les épitopes de lymphocytes T dans les quatre protéines structurales chez les souris infectées par le SRAS-CoV, ainsi que plusieurs épitopes de lymphocytes T chez les souris BALB / c infectées par le MERS-CoV. Cette étude compare le nombre d'infections.

L'épitope de cellules T de SARS-CoV-2 chez la souris et l'épitope de cellule T de SARS-CoV et MERS-CoV chez les souris BALB / c et C57BL / 6. La figure 6a résume les mêmes épitopes et les épitopes de lymphocytes T à réactivité croisée possibles. Chez les souris BALB / c, la séquence principale de l'épitope dominant des lymphocytes T CD4 + du SARS-CoV (N353-370) et du SARS-CoV-2 (N351-365) est la même et est la même que celle du MERS-CoV (N350 -362) La séquence centrale de l'épitope dominant des lymphocytes T CD4 + est différente. Entre le SARS-CoV (S521-529) et le SARS-CoV-2 (S535-543; Figure 6a), il existe une différence d'acides aminés dans l'épitope dominant des lymphocytes T CD8 +.Chez les souris C57BL / 6, les trois épitopes de cellules T CD8 + du SARS-CoV-2 sont les mêmes que ceux du SARS-CoV. Aucun epitope de lymphocytes T conservé entre SARS-CoV-2 et MERS-CoV n'a été trouvé chez les souris C57BL / 6 (figure 6a).

Ensuite, chez des souris infectées par le SRAS-CoV-2, il a été testé si ces épitopes potentiels de cellules T à réactivité croisée induisaient réellement des réponses de cellules T à réactivité croisée. Les lymphocytes T CD4 + dans le BALF de souris infectées par le SRAS-CoV-2 répondent à la stimulation peptidique du SRAS-CoV-2 (N351-365) et du SRAS-CoV (N353-370), mais au MERS-CoV (N350-362) Non réponse peptidique (figure 6B). Le peptide SARS-CoV (S521-529) a réussi à stimuler les cellules T CD8 + de souris BALB / c infectées par SARS-CoV-2, avec un taux de réaction croisée> 70% (figure 6c).Comme prévu, ils sont stimulés avec le peptide S535-543, les cellules T CD8 + à réaction croisée SARS-CoV-2 (S535-543) ont montré une affinité fonctionnelle plus élevée que le peptide SARS-CoV (S521-529 ) (figure 6 D). Ces données démontrent clairement l'existence d'une réponse des lymphocytes T à réactivité croisée entre les infections SARS-CoV et SARS-CoV-2 chez les souris BALB / c.

Image 6. Chez les souris infectées par le SRAS-CoV-2, il existe une réaction des lymphocytes T à une réaction croisée entre le SRAS-CoV-2 et le SRAS-CoV. (A) Les caractéristiques des épitopes de lymphocytes T conservés dans SARS-CoV-2, SARS-CoV et MERS-CoV. (B et C) Les souris BALB / C sont infectées par le SRAS-CoV-2. Les lymphocytes des voies respiratoires ont été préparés à 8d.pi et stimulés avec l'épitope transformée. L'expression de l'IFN-y a été testée pour la réponse des cellules CD4 + (B) et CD8 + T (C). Le diagramme de flux (à gauche) et la vitesse de réaction croisée (à droite) sont représentés (n = 3 ou 4 souris par groupe; les données représentent deux expériences indépendantes).(D) montre la courbe d'affinité fonctionnelle des cellules T CD8 + spécifiques de S535 et des cellules T CD8 + réactives croisées S521 (à gauche) et la quantité de peptide requise pour la réponse demi-maximale (EC50) (à droite; n = 3 souris; données représentent deux expériences indépendantes; le test t de Student; la valeur P de D est 0,0182). *, P <0. 05. Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM. Max, valeur maximale; pep, polypeptide.

 

 

Discuter:

La pandémie de COVID-19 est une menace sérieuse pour la santé publique et un conduit à une augmentation massive du nombre de patients hospitalisés pour une pneumonie et un dysfonctionnement de plusieurs organes. La pathogenèse immunitaire n'est toujours pas claire, ce qui entrave le développement de nouvelles mesures préventives et thérapeutiques, y compris la conception et la validation des vaccins.

De nombreux virus respiratoires sont regroupés dans les cellules T, y compris le SRAS-CoV et le MERS-CoV. Les cellules T spécifiques du CoV jouent un rôle indirect ou direct dans la clairance virale et l'immunité. Chez les souris infectées par le SRAS-CoV, les lymphocytes T CD4 + à mémoire des voies respiratoires favorisent la migration des cellules dendritiques des voies respiratoires en régulant à la hausse de l'expression de CCR7 et activent la voie stati en produisant de l'IFN -γ, conduisant à une réponse des lymphocytes T CD8 + cytotoxiques plus puissants, et augmentant l'expression de la chimiokine CXCL9-11 au site de l'infection pour suivre les cellules T CD8 + qui sont plus spécifiques du virus.Cependant, chez les souris infectées par le SRAS-CoV-2, les épitopes des lymphocytes T sont encore inconnus.

C'est la clé pour comprendre la pathogenèse immunitaire et valider les vaccins et les thérapies. Nous avons identifié des épitopes de cellules T chez des souris infectées par le SRAS-CoV-2 et utilisé une bibliothèque de peptides contenant les quatre protéines structurelles et six accessoires, dont six des souris BALB / c et C57BL / 6 restreintes à l ' I-Ad, 3 H2-K / Dd restreint, 5 I-Ab restreint et 10 épitopes de lymphocytes T restreints H2-K / Db. Chez les souris BALB / c (N351) et les souris C57BL / 6 (orf3a266), les epitopes de cellules T CD4 + dominants sont localisés dans la protéine N. Chez les souris BALB / c (S535) et les souris C57BL / 6 ( S538), les epitopes de lymphocytes T CD8 + dominants sont situés dans la protéine S.

La sélection des épitopes identifiés par les cellules T est restreinte par le CMH, de sorte que les épitopes identifiés par les cellules T chez les souris BALB / c et C57BL / 6 sont différents. La réponse des cellules T CD8 + des souris C57BL / 6 est plus forte que celle des souris BALB / c, ce qui peut aider les souris C57BL / 6 à éliminer le virus plus rapidement.

Les cellules T spécifiques du virus respiratoire constituant la première ligne de défense contre les défis et améliorent la réponse immunitaire tôt après l'infection. Par rapport aux cellules parenchymateuses pulmonaires, les cellules T CD4 + et CD8 + spécifiques du SRAS-CoV-2 dérivées des voies respiratoires sont des cellules effectrices supérieures, ce qui est cohérent avec les études précédentes. Chez les souris IFNAR-KO, la fréquence et le nombre de cellules T totales et multifonctionnelles spécifiques du virus et la sensibilité à la stimulation antigénique sont réduits, ce qui entraîne un retard de la clairance virale, ce qui indique que le signal IFN-I est optimisé pour le SRAS-CoV-2 - Les fonctions nécessaires à la production et à l'expression de cellules T spécifiques sont cohérentes.Avec cela, les patients COVID-19 avec une fonction immunitaire faible ont une charge virale, un taux d'hospitalisation, un taux d'admission en unité de soins intensifs et des maladies respiratoires graves plus élevées.

Afin d'explorer si les lymphocytes T mémoire spécifiques au virus peuvent assurer la médiation de la protection à long terme seuls, nous avons construit un vecteur VRP exprimant un seul épitope de lymphocytes T CD4 + ou CD8 + spécifiques du SARS-CoV-2. 4 semaines après que les souris ont été inoculées avec VRP, le titre viral a diminué modérément et les lésions pulmonaires ont été atténuées, ce qui peut partiellement protéger les souris de l'infection par le SRAS-CoV-2. Cette expérience fournit une preuve directe de l'effet protecteur des cellules T mémoire.

Enfin, cette étude a identifié plusieurs épitopes de cellules T à réactivité croisée entre le SRAS-CoV et le SARS-CoV-2 chez les souris BALB / c et C57BL / 6, mais le MERS-CoV n'a pas été identifié. Ni le SRAS-CoV-2 ni le SRAS-CoV n'ont de vaccin homologué. Un vaccin durable peut induire une protection étendue contre plusieurs coronavirus, ce qui sera utile et peut fournir une protection à long terme pour d'autres coronavirus de type SRAS qui pourraient émerger à l'avenir.

En conclusion, nous avons prouvé que le SRAS-CoV-2 induisait une forte réponse des lymphocytes T chez la souris. Dans cette étude, des épitopes de cellules T ont été identifiés à la fois chez les souris BALB / c et C57BL / 6. Les cellules CD4 + T et CD8 + T spécifiques du SRAS-CoV-2 sont multifonctionnelles, capables de lyser les cellules cibles in vivo et de protéger les souris contre l'infection par le SRAS-CoV-2 en l'absence d'anticorps neutralisants. De plus, la voie IFN-I s'est avérée être la clé de la meilleure réponse antivirale des lymphocytes T après une infection par le SRAS-CoV-2.De plus, il existe une réaction des lymphocytes T à une réaction croisée entre le SRAS-CoV et le SRAS-CoV-2 chez la souris, mais il n'y a pas de réaction des lymphocytes T à une réaction croisée entre le MERS-CoV. L'identification des épitopes des lymphocytes T et l'étude des caractéristiques de la réponse des lymphocytes T participe non seulement à l'étude de la pathogenèse immunitaire de la maladie COVID-19 chez la souris,

 

 

 

 

 

(source: internet, référence uniquement)